在外泌体western鉴定研究领域，NTA技术已被用作外泌体表征手段之一。相较于其他表征方式，NTA技术的样本处理更简单，更能保证外泌体原始状态，检测速度更快。大致方法是：将收集的外泌体用PBS稀释至10^6/mL，用1 mL注射器注入纳米颗粒跟踪分析仪(如装有450 nm激光器的Nanosight NS300颗粒粒度分析仪)；激光光束穿过样本室外泌体颗粒，通过装有摄像头的显微镜实现颗粒可视化，捕捉外泌体的布朗运动，利用爱因斯坦方程式根据其运动计算浓度和流体力学直径。SBI公司新开发的一种排除非外泌体颗粒干扰的试剂盒，还可帮助实现对完整外泌体的NTA分析。除了NTA以外，还有种动态光散射技术（DLS），其原理是：用一束激光打向存放样品的容器，再在90°这样一个角度去检测散射光，得到散射光光强图谱，通过对图谱进行时间相关分析；时间分析图中开始衰减的地方就代表着外泌体的粒径大小，但是缺少浓度信息；也就是说DLS其实就是通过对不同时间散射光强度的分析，从而得到外泌体相应的粒径。
扫描电镜（SEM）的工作原理是用能量为1~30 KV间的电子束，以光栅状扫描方式照射到被分析试样的表面上，利用入射电子和试样表面物质相互作用所产生的二次电子和背散射电子成像，获得试样表面微观组织结构和形貌的高分辨率信息。由于超高真空技术的发展，场发射电子枪的应用得到普及，现代先进的SEM的分辨率已经达到1 nm左右，足够用来进行外泌体尺寸的测量。透射电镜（TEM）是把经加速和聚集的电子束投射到非常薄的样品上，电子与样品中的原子碰撞而改变方向，从而产生立体角散射。散射角的大小与样品的密度、厚度相关，因此可以形成明暗不同的影像，影像放大、聚焦后在成像器件(如荧光屏、胶片、感光耦合组件)上显示出来。
外泌体western鉴定时通常会检测哪些指标蛋白？
根据22篇外泌体相关文献的统计，排在前4位的检测指标为CD63（13/22）、Tsg101(8/22)、 CD9和CD81并列第三位（6/22）；接着检测较多的4个指标为Alix（4/22）、 HSP70(3/22)、 flotillin (3/22)和Syntenin (2/22)；此外还有一些指标仅在1篇文献中出现过，例如HSP90、LAMP2B、LMP1、ADAM10、nicastrin、AChE、AQP2、RPL5、a-1AT。
针对外泌体的定性检测至少选择两个指标就能满足文章发表需要了，比如检测CD63和Tsg101。
外泌体western鉴定定性检测中有没有阳性对照？
从发表的文章来看，并没有一篇文章结果中提到了阳性对照样品，但是已经被文献报道的样品可以作为后人Western blot检测实验的阳性对照，通过这样阳性样品的检测来判断实验体系是否正常。罗列一下文献中的阳性对照样品：脂肪组织巨噬细胞外泌体、神经干细胞外泌体、大鼠皮层神经元外泌体、SCC-9和Cal-27细胞外泌体、MDA-MB-231外泌体、星型胶质细胞外泌体、中性白细胞外泌体等。
外泌体western鉴定主要检测指标为CD63、CD9、CD81、Tsg101、Alix、HSP70等，针对外泌体的定性检测，至少选择2-3个指标就能满足文章发表就可以。大部分文献中没有检测内参，个别文章中使用了Actin、GAPDH和Tubulin作为内参进行检测，外泌体中的Actin、GAPDH和Tubulin的表达丰度相对于正常细胞样品中的较低，可能会检测不到任何条带或者条带微弱。
外泌体western鉴定操作步骤大致是：
用PBS重悬提取的外泌体，滴于孔径2 nm的载样铜网上，室温静置2 min，用滤纸从滤网侧边吸干液体，用3%磷钨酸溶液在室温下负染5 min，滤纸吸干负染液，室温晾干，电镜观察拍照。外泌体在电镜下具有非常明显的膜边界、呈30~100 nm大小不一的茶托或杯状结构(也会有200 nm以下、较难鉴别的其他形状的外泌体)，但电镜对样品的预处理和制备要求较高，样品分离方法和样品性质可能影响电镜结果的好坏；样品的准备阶段比较复杂，不适合对外泌体进行大量快速的测量；且因外泌体经过了预处理和制备过程，无法准确测量。
扫描电镜(scanning electron microscopy, SEM)或透射电镜(transmission electron microscopy, TEM)等电子显微镜可用于外泌体鉴定。SEM的工作原理是用能量为1~30 KV间的电子束，以光栅状扫描方式照射到被分析试样的表面上，利用入射电子和试样表面物质相互作用所产生的二次电子和背散射电子成像，获得试样表面微观组织结构和形貌的高分辨率信息。由于超高真空技术的发展，场发射电子枪的应用得到普及，现代先进的SEM的分辨率已经达到1 nm左右，足够用来进行外泌体尺寸的测量。TEM是把经加速和聚集的电子束投射到非常薄的样品上，电子与样品中的原子碰撞而改变方向，从而产生立体角散射。散射角的大小与样品的密度、厚度相关，因此可以形成明暗不同的影像，影像放大、聚焦后在成像器件(如荧光屏、胶片、感光耦合组件)上显示出来。
以上两种方法是常用的外泌体的鉴定方法，是展开外泌体功能研究的前提。比如在肿瘤研究中，通过提取鉴定不同细胞系中的外泌体，进而通过PCR以及测序筛选分析RNA，探究外泌体在肿瘤进展或者耐药中的发生机制。
