一、生物样品扫描电镜具体步骤

　　样品准备

　　取材：根据研究目的准确取材，确保样品具有代表性且体积不宜过大，一般不超过8mm×8mm，厚度不超过5mm。对于易卷曲的样品如血管、胃肠道粘膜等，需固定在滤纸或卡片纸上以充分暴露待观察的表面。

　　固定：样品需进行双固定处理，先用1%-3%的戊二醛/缓冲液在室温或4°C下前固定，时间根据样品特性而定。随后用1%饿酸/缓冲液在4°C下进一步固定。固定过程旨在保持样品的形态和结构。

　　清洗：对于表面凹凸不平或有杂质的样品，在固定前后需进行清洗，以去除杂质，避免影响成像质量。

　　脱水与置换

　　逐级脱水：样品需经系列浓度的乙醇或丙酮逐级脱水，一般从30%、50%、70%、80%、95%至100%，每步处理10-15分钟。

　　置换：用乙酸异戊酯置换100%乙醇，室温下放置20分钟以上，以减少样品在干燥过程中的收缩和变形。

　　干燥

　　干燥方法多样，包括临界点干燥、空气干燥、化学药品干燥和冷冻干燥等。干燥过程需确保样品表面形貌不被破坏，且样品需干燥无水、无易挥发溶剂，以避免对电镜造成损伤。

　　导电处理

　　喷涂导电膜：在真空条件下，对样品表面喷涂10-20nm厚的金或铝膜，以增强样品的导电性，确保电子束能顺利释放二次电子，从而改善图像的亮度和反差。

　　上镜观察

　　将处理好的样品放置在扫描电镜的样品台上，调整样品高度至距电子枪既定距离(一般约10mm)。

　　启动扫描电镜，设置加速电压、放大倍数、扫描速度等参数，通过控制器和电脑对样品进行观察，获取样品的形貌和结构信息。

　　二、检定过程中需要注意的事项

　　样品准备质量

　　确保样品制备过程中的每一步都精细操作，避免对样品造成机械损伤或化学污染。

　　固定、清洗、脱水和干燥等步骤需严格控制时间和条件，以保证样品的形态和结构不被破坏。

　　电镜操作环境

　　保持操作环境清洁无尘、无震动、无电磁干扰，以保证扫描电镜的稳定性和准确性。

　　定期清洁和维护电镜设备，确保其长期稳定运行。

　　参数设置与校准

　　根据样品的特性和观察需求合理设置扫描电镜的参数，如加速电压、放大倍数等，以获得最佳的图像质量和分辨率。

　　在观察前进行必要的校准操作，如调整电子束的扫描速度和扫描模式等，以确保图像的准确性和稳定性。

　　样品导电性

　　对于非导电样品，喷涂导电膜是一步。导电膜的厚度需适中，既能改善图像质量又不掩盖样品结构。

　　对于某些无法喷镀导电膜的样品，可采用低真空模式观察以缓解荷电效应。

　　安全注意事项

　　在操作过程中佩戴干净无粉手套，避免直接接触样品和设备以减少污染。

　　注意个人防护措施，避免长时间暴露在电子束辐射下。

　　遵守实验室安全规程，确保设备和人员的安全。

　　综上所述，生物样品扫描电镜技术涉及多个精细步骤和注意事项。只有严格按照操作规范进行样品准备和检定过程，才能获得高质量的观察结果并确保电镜设备的长期稳定运行。随着技术的不断进步和应用领域的扩展，扫描电镜将在生命科学研究中发挥更加重要的作用。